The milk-clotting enzyme chymosin is a member of the group of aspartate proteinases. Chymosin is the main component of rennet traditionally obtained from the stomachs of dairy calves and widely used to coagulate milk in the production of various types of cheese. Another source of chymosin, which does not require the killing of animals, is based on recombinant DNA technology. Recombinant alpaca chymosin has a number of valuable technological properties that make it attractive for use in cheese-making as an alternative to recombinant bovine chymosin. The purpose of this work is to study the effect of coexpression of thioredoxin and prochymosin on the refolding of the recombinant zymogen and the activity of alpaca chymosin. To achieve this goal, on the basis of the pET32a plasmid, an expression vector was constructed containing the thioredoxin A gene fused to the N-terminal sequence of the marker enzyme zymogen, alpaca prochymosin. Using the constructed vector, pET-TrxProChn, a strain-producer of the recombinant chimeric protein thioredoxin-prochymosin was obtained. The choice of prochymosin as a model protein is due to the ability of autocatalytic activation of this zymogen, in which the pro-fragment is removed, together with the thioredoxin sequence attached to it, with the formation of active chymosin. It is shown that Escherichia coli strain BL21 transformed with the pET-TrxProChn plasmid provides an efficient synthesis of the thioredoxin-prochymosin chimeric molecule. However, the chimeric protein accumulates in inclusion bodies in an insoluble form. Therefore, a renaturation procedure was used to obtain the active target enzyme. Fusion of thioredoxin capable of disulfide-reductase activity to the N-terminal sequence of prochymosin provides optimal conditions for zymogen refolding and increases the yield of recombinant alpaca chymosin immediately after activation and during long-term storage by 13 and 15 %, respectively. The inclusion of thioredoxin in the composition of the chimeric protein, apparently, contributes to the process of correct reduction of disulfide bonds in the prochymosin molecule, which is reflected in the dynamics of the increase in the milk-clotting activity of alpaca chymosin during long-term storage.
Молокосвертывающий фермент химозин является представителем группы аспартатных протеиназ. Химозин – основной компонент сычужного фермента, традиционно получаемого из желудков телят-молокопоек и широко используемого для свертывания молока при производстве разнообразных видов сыра. Другой источник химозина, не требующий умерщвления животных, базируется на технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантный химозин альпака обладает рядом ценных технологических свойств, делающих его привлекательным для использования в сыроделии в качестве альтернативы рекомбинантному химозину коровы. Цель настоящей работы – исследование влияния коэкспрессии тиоредоксина и прохимозина на рефолдинг рекомбинантного зимогена и активность химозина альпака. Для достижения поставленной цели на основе плазмиды pET32a был сконструирован экспрессионный вектор, содержащий ген тиоредоксина А, слитый с N-концевой последовательностью зимогена маркерного фермента – прохимозина альпака. С помощью сконструированного вектора pET-TrxProChn создан штамм-продуцент рекомбинантного химерного белка тиоредоксин-прохимозин. Выбор прохимозина в качестве модельного белка обусловлен способностью этого зимогена к автокаталитической активации, при которой происходит удаление профрагмента вместе с присоединенной к нему последовательностью тиоредоксина с образованием активного химозина. Показано, что штамм Escherichia coli BL21, трансформированный плазмидой pET-TrxProChn, обеспечивает эффективный синтез химерной молекулы тиоредоксин-прохимозин. Однако химерный белок накапливается в тельцах включения в нерастворимой форме. Поэтому для создания активного целевого фермента была использована процедура ренатурации. Присоединение тиоредоксина, обладающего способностью восстанавливать дисульфидные связи, к N-концевой последовательности прохимозина обеспечивает оптимальные условия для рефолдинга зимогена и увеличивает выход рекомбинантного химозина альпака сразу после активации и при длительном хранении на 13 и 15 % соответственно. Включение тиоредоксина в состав химерного белка, по всей видимости, способствует процессу корректного восстановления дисульфидных связей в молекуле прохимозина, что отражается на динамике роста молокосвертывающей активности химозина альпака при длительном хранении.
Keywords: inclusion bodies; milk-clotting activity; recombinant chymosin (rChn); renaturation; thioredoxin (Trx).
Copyright © AUTHORS.