There are more than 30 inherited human disorders connected with repeat expansion (myotonic dystrophy type I, Huntington's disease, Fragile X syndrome). Fragile X syndrome is the most common reason for inherited intellectual disability in the human population. The ways of the expansion development remain unclear. An important feature of expanded repeats is the ability to form stable alternative DNA secondary structures. There are hypotheses about the nature of repeat instability. It is proposed that these DNA secondary structures can block various stages of DNA metabolism processes, such as replication, repair and recombination and it is considered as the source of repeat instability. However, none of the hypotheses is fully confirmed or is the only valid one. Here, an experimental system for studying (CGG)n repeat expansion associated with transcription and TCR-NER is proposed. It is noteworthy that the aberrations of transcription are a poorly studied mechanism of (CGG)n instability. However, the proposed systems take into account the contribution of other processes of DNA metabolism and, therefore, the developed systems are universal and applicable for various studies. Transgenic cell lines carrying a repeat of normal or premutant length under the control of an inducible promoter were established and a method for repeat instability quantification was developed. One type of the cell lines contains an exogenous repeat integrated into the genome by the Sleeping Beauty transposon; in another cell line, the vector is maintained as an episome due to the SV40 origin of replication. These experimental systems can serve for finding the causes of instability and the development of therapeutic agents. In addition, a criterion was developed for the quantification of exogenous (CGG)n repeat instability in the transgenic cell lines' genome.
Существует ряд наследственных заболеваний человека, причиной которых является экспансия тандемных повторов. К ним относятся миотоническая дистрофия первого типа, болезнь Хантингтона, заболевания, ассоциированные с ломкой Х-хромосомой. Синдром ломкой Х-хромосомы – наиболее распространенная причина наследственной умственной отсталости у человека. На сегодняшний день причины развития экспансии остаются неисследованными. Важная особенность протяженных повторов – их способность формировать альтернативные вторичные структуры ДНК. Существуют гипотезы, объясняющие природу нестабильности повторов, однако все они предполагают возникновение устойчивых вторичных структур ДНК на различных этапах клеточного цикла. Источником нестабильности считаются нарушения в различных процессах метаболизма ДНК (репликация, репарация и рекомбинация), вызванные образованием вторичных структур. Однако ни одна из гипотез до конца не подтверждена и, видимо, не является единственно верной. Вероятно, в различных типах клеток и на определенных стадиях клеточного цикла источником нестабильности выступает множество процессов. В настоящей работе мы предлагаем экспериментальную систему для изучения вклада транскрипции и ассоциированной с ней репарации в нестабильность повтора (CGG)n, поскольку это наименее изученный механизм возникновения нестабильности. Однако предложенные модели могут учитывать вклад и других процессов метаболизма ДНК, например репликации, что делает полученные системы универсальными и применимыми в разных исследованиях. Нами были созданы трансгенные клеточные линии, несущие повтор нормальной и премутантной длины под тетрациклин-индуцируемым промотором. Один тип линий содержит плазмиду с экзогенным повтором, интегрированным в геном посредством транспозона Sleeping Beauty, в другой клеточной линии вектор поддерживается в виде эписомы благодаря ориджину репликации SV40. Такие трансгенные клеточные линии могут служить экспериментальной системой для поиска причин нестабильности и создания терапевтических средств. Кроме того, был разработан критерий для оценки нестабильности экзогенного (CGG)n повтора в геноме трансгенных клеточных линий, расчет которого не зависит от эффективности синтеза протяженных повторов.
Keywords: fragile X syndrome; hereditary intellectual disability; repeat expansion; replication; somatic instability; transcription; transgenic cell lines.
Copyright © AUTHORS, 2021.