Objective: At present, there are a limited number of facilities in Turkey that can provide reliable real-time quantitative(RQ)-PCR BCR-ABL results. The present study aimed to test a cost-effective, in-house method of BCR-ABL quantification,including verification of the method by RQ-PCR validation tests.
Material and methods: BCR-ABL and ABL target sequences were cloned into pJET1.2 vectors, from whichcalibrators were prepared and used as templates in RQ-PCR reactions to generate standard curves. Dilutions of K562cells (representing an in vitro simulation of BCR-ABL transcript reduction) were analyzed.
Results: Standard curves were generated from calibrators. These curves were then used to calculate the BCR-ABL andABL copy numbers; in which linear BCR-ABL results were obtained. Repetitive experiments showed that our methodologywas able to detect 1 BCR-ABL positive cell from amnong 1x105 cells.
Conclusion: The method described herein is suitable for implementation with any RQ-PCR instrument and/or kit forquantify BCR-ABL transcripts.
Conflict of interest: None declared.
Amaç: Türkiye’de BCR-ABL gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir tepkimesi ile BCR-ABL düzey tayini yapabilen merkezlerin sayısı, ihtiyacın altında kalmaktadır. BCR-ABL kantitasyonu için laboratuarımızda geliştirmiş olduğumuz yöntem temel alınarak, (PZT) ile kantitasyonun basamakları, iç kontrolleri ve geçerlilik testleri anlatılmıştır. Gereç ve Yöntemler: BCR-ABL ve ABL hedef dizileri pJET1.2 vektörlerine klonlandıktan sonra kalibratörler hazırlanmış ve gerçek zamanlı PZT tepkimelerinde kalıp olarak kullanılarak standart eğriler çizilmiştir. Bu standart eğriler kullanılarak K562 hücre dilüsyonlarının analizi yapılmıştır. Bulgular: Önceden elde edilen standart eğriler kullanılarak BCR-ABL ve ABL kopya sayıları hesaplanmış; lineer sonuçlar elde edilmiştir. Tekrarlayan deneylerle yöntem duyarlılığının 1x105 hücrede bir BCR-ABL pozitif hücreyi saptayacak düzeyde olduğu gösterilmiştir. Sonuç: Bu makalede tarif elden protokollerin geçerliliği/güvenirliliği gösterilmiştir. Kullanılan yaklaşım, BCR-ABL kantitasyonunun hedefleyen diğer gerçek zamanlı PZT kit ve cıhazlarına da uyarlanabilmektedir.
Keywords: BCR-ABL; Chronic myeloid leukemia; Molecular response; Real-time PCR.