For therapeutic purposes, large numbers of dendritic cells (DCs) are essential. In this study, we used 2% autologous canine plasma, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), and interleukin 4 (IL-4) in generating monocyte-derived DCs from peripheral blood mononuclear cells of dogs. The plasma enriched the population of CD14-positive monocytes by greatly enhancing the efficiency of monocyte adherence, the proportion of adherent cells increasing from 6.6% with 10% fetal bovine serum to 15.3% with 2% autologous canine plasma. Culturing the adherent monocytes for 6 d with human GM-CSF, canine IL-4, and human Flt3L significantly increased the yield of DCs, more than 90% of which were CD14-negative. Because, in the presence of lipopolysaccharide (LPS), monocytes that were CD14-positive expressed tumor necrosis factor ac much more than DCs with low levels of CD14, it is important to decrease the numbers of CD14-positive cells in generating monocyte-derived DCs. With flow cytometry and real-time reverse-transcriptase-mediated polymerase chain reaction assays, we found that in canine immature DCs (iDCs) the expression of DLA class II molecules, CD1a, CD11c, CD40, and CD86 was high and the expression of CD80, CD83, and CD14 either low or negative. During maturation (stimulated by LPS), the expression of CDla, CD40, CD83, and CD80 was upregulated. However, the expression of DLA class II molecules, CD11c, and CD86 was not increased in mature DCs. Incubating the iDCs with LPS decreased antigen uptake and increased the cells' immunostimulatory capacity (assessed by the allogeneic mixed-lymphocyte reaction), indicating that LPS accelerates the functional maturation of DCs. This protocol may facilitate the use of DCs in cellular immunotherapy.
Lorsqu’utilisées à des fins thérapeutiques, de grandes quantités de cellules dendritiques (DCs) sont essentielles. Dans la présente étude nous avons utilisé du plasma canin autologue à 2 %, du facteur stimulant de colonies des granulocytes/macrophages (GM-CSF), un analogue du ligand de la tyrosine kinase 3 (Flt3L), et de l’interleukine 4 (IL-4) afin de générer des DCs de chien dérivés des monocytes à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique. Le plasma autologue a été utilisé pour enrichir des monocytes CD14+ : l’efficacité d’adhérence des monocytes était grandement augmentée, la proportion de cellules adhérentes augmentant de 6,6 % avec du sérum fœtal de veau à 10 % à 15,3 % avec le plasma à 2 %. La cultivation des monocytes adhérents pendant 6 jours avec du GM-CSF et Flt3L humain et du IL-4 canin augmenta de manière significative la récolte de DCs, et plus de 90 % des DCs étaient CD14−. Étant donné qu’en présence de lipopolysaccharide (LPS) les monocytes qui étaient CD14+ exprimaient le facteur de nécrose tumorale α beaucoup plus que les DCs avec un bas niveau de CD14, il est important de diminuer le nombre de cellules CD14+ lorsque l’on génère des DCs dérivées de monocytes. Avec la cytométrie en flux et la réaction d’amplification en chaîne par la polymérase en temps réel utilisant la transcriptase réverse, nous avons trouvé que chez DCs canines immatures l’expression de DLA de classe II, CD1a, CD11c, CD40, et CD86 était élevée et que l’expression de CD80, CD83, et CD14 était soit faible ou négative. Durant la maturation (stimulée par le LPS), il y avait une régulation à la hausse de CD1a, CD40, CD83, et CD80. Toutefois, il n’y avait pas d’augmentation des DLA de classe II, CD11c, et CD86 dans les DCs matures. L’incubation de DCs immatures avec du LPS diminuait l’absorption d’antigènes et augmentait la capacité d’immunostimulation (évaluée par la réaction lymphocytaire allogénique mixte), indiquant ainsi que le LPS accélérait la maturation fonctionnelle de DCs. Ce protocole pourrait faciliter l’utilisation de DCs lors d’immunothérapie cellulaire.
(Traduit par Docteur Serge Messier)