Rhodococcus equi can cause severe or fatal pneumonia in foals as well as in immunocompromised animals and humans. Its ability to persist in macrophages is fundamental to how it causes disease, but the basis of this is poorly understood. To examine further the general application of a recently developed system of targeted gene mutation and to assess the importance of different genes in resistance to innate immune defenses, we disrupted the genes encoding high-temperature requirement A (htrA), nitrate reductase (narG), peptidase D (pepD), phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase (purC), and superoxide dismutase (sodC) in strain 103 of R. equi using a double-crossover homologous recombination approach. Virulence testing by clearance after intravenous injection in mice showed that the htrA and narG mutants were fully attenuated, the purC and sodC mutants were unchanged, and the pepD mutant was slightly attenuated. Complementation with the pREM shuttle plasmid restored the virulence of the htrA and pepD mutants but not that of the narG mutant. A single-crossover mutation approach was simpler and faster than the double-crossover homologous recombination technique and was used to obtain mutations in 6 other genes potentially involved in virulence (clpB, fadD8, fbpB, glnA1, regX3, and sigF). These mutants were not attenuated in the mouse clearance assay. We were not able to obtain mutants for genesfurA, galE, and sigE using the single-crossover mutation approach. In summary, the targeted-mutation system had general applicability but was not always completely successful, perhaps because some genes are essential under the growth conditions used or because the success of mutation depends on the target genes.
Rhodococcus equi peut causer une pneumonie sévère ou fatale chez les poulains aussi bien que chez les animaux ou humains immunocompromis. Sa capacité à persister dans les macrophages est fondamentale à sa pathogénie, mais la base de ce phénomène est mal connue. Afin d’examiner plus en détails l’application générale d’un nouveau système de mutation génétique dirigée et d’évaluer l’importance de différents gènes dans la résistance à la réponse immunitaire innée, un dérèglement des gènes codant pour la protéase htrA (htrA), la nitrate réductase (narG), la peptidase D (pepD), la phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthétase (purC) et la superoxide dismutase (sodC) de la souche 103 de R. equi a été produit à l’aide d’une approche utilisant une recombinaison homologue à double croisement. Une évaluation de la virulence par évaluation de la clairance après injection intraveineuse chez la souris a permis de démontrer que les mutants htrA et narG étaient complètement atténués, les mutants purC et sodC étaient inchangés et le mutant pepD était légèrement atténué. Une complémentation avec le plasmide vecteur pREM a rétabli la virulence des mutants htrA et pepD mais pas celle du mutant narG. Une approche de mutation par croisement unique était plus simple et rapide que la technique de recombinaison homologue à double croisement et a été utilisée afin d’obtenir des mutations dans six autres gènes potentiellement impliqués dans la virulence (clpB, fadD8, fbpB, glnA1, regX3 et sigF). Ces mutants n’étaient pas atténués dans l’épreuve de clairance chez la souris. Il a été impossible d’obtenir des mutants pour les gènes furA, galE et sigE en utilisant l’approche de mutation par croisement unique. En résumé, le système à mutation dirigée a une application globale mais le résultat désiré n’est pas toujours obtenu, peut-être parce que certains gènes sont essentiels dans les conditions de culture utilisées ou parce que le succès de la mutation dépend des gènes ciblés.
(Traduit par Docteur Serge Messier)