The objective of this study was to develop and test both a flow cytometry method (FCM) and a direct count method (DCM) that both use fluorescent stains to determine the viability of Lawsonia intracellularis (LI), an obligate intracellular bacterium and the cause of proliferative enteropathy (PE) in pigs and other animal species. Live LI were passaged in cell culture and harvested from infected McCoy cells. Dead LI were prepared by exposing live LI to 70% isopropyl alcohol for 30 min. Seven samples with dead:live ratios of 0:100 (live control), 10:90, 30:70, 50:50, 70:30, 90:10, and 100:0 (dead control) were prepared for testing by both the FCM and the DCM. For the FCM, TO-PRO-3 iodine was applied to the samples, and viable LI were counted. For the DCM, the samples were stained with LIVE/DEAD BacLight, which contains SYTO 9 and propidium iodine, then filtered through 0.2-microm Nuclepore black polycarbonate filters, viewed, and counted with the use of an epifluorescence microscope. Data were evaluated by estimating 95% limits of agreement and the concordance correlation coefficient (CCC). The limits of agreement between the FCM and the DCM versus the standard ratio of added LI showed mean differences not equal to zero, suggesting that systematic bias was introduced. The CCC showed almost perfect agreement (r = 0.9898). With a specific fluorescent probe, the FCM is useful and as good as the DCM for determining LI viability.
L’objectif de cette étude était de développer et tester une méthode par cytométrie (FCM) et une méthode de dénombrement direct (DCM) utilisant toutes deux des colorants fluorescents afin de déterminer la viabilité de Lawsonia intracellularis, une bactérie intracellulaire obligatoire et l’agent étiologique de l’entéropathie proliférative (EP) chez le porc ainsi que chez d’autres espèces animales. Une préparation de L. intracellularis vivante a été obtenue par passage en culture cellulaire et récolte à partir de cellules McCoy infectées. Une suspension de L. intracellularis morte a été préparée en exposant des bactéries vivantes à une solution d’alcool isopropylique 70 % pendant 30 minutes. Sept échantillons avec des ratios de cellules mortes:cellules vivantes de 0:100 (témoin cellules vivantes), 10:90, 30:70, 50:50, 70:30, 90:10 et 100:0 (témoin cellules mortes) ont été préparés pour essai par FCM et DCM. Pour le test par FCM, de l’iode TO-PRO-3 a été mis en contact avec tous les échantillons et les cellules de L. intracellularis vivantes ont été comptées. Pour le test DCM, les échantillons ont été colorés avec le produit LIVE/DEAD BacLight, qui contient du SYTO 9 et de l’iode de propidium, puis passés sur filtres Nuclepore de 0,2 μm en polycarbonate, visualisés et comptés à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Les données ont été évaluées en estimant les limites de 95 % d’accord ainsi que le coefficient de corrélation de concordance (CCC). Les limites d’accord entre le FCM et le DCM versus le ratio standard de L. intracellularis ajouté a démontré des différence moyennes non égales à zéro, ce qui suggère qu’un biais systématique était introduit. Le CCC a démonté un accord presque parfait (r = 0,9898). En utilisant une sonde fluorescente spécifique le FCM est utile et aussi efficace que le DCM pour déterminer la viabilité de L. intracellularis.
(Traduit par Docteur Serge Messier)