Introduction: Polymerase proteins PB1 and PB2 determine the cold-adapted phenotype of the influenza virus A/Krasnodar/101/35/59 (H2N2), as was shown earlier.
Objective: The development of the reporter construct to determine the activity of viral polymerase at 33 and 37 °C using the minigenome method.
Materials and methods: Co-transfection of Cos-1 cells with pHW2000 plasmids expressing viral polymerase proteins PB1, PB2, PA, NP (minigenome) and reporter construct.
Results: Based on segment 8, two reporter constructs were created that contain a direct or inverted NS1-GFP-NS2 sequence for the expression of NS2 and NS1 proteins translationally fused with green fluorescent protein (GFP), which allowed the evaluation the transcriptional and/or replicative activity of viral polymerase.
Conclusion: Polymerase of virus A/Krasnodar/101/35/59 (H2N2) has higher replicative and transcriptional activity at 33 °C than at 37 °C. Its transcriptional activity is more temperature-dependent than its replicative activity. The replicative and transcriptional activity of polymerase A/Puerto Rico/8/34 virus (H1N1, Mount Sinai variant) have no significant differences and do not depend on temperature.
Холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) содержит мутации в полимеразных белках PB1 и PB2, которые определяют его ts-фенотип, что было показано ранее. В настоящей работе для выяснения активности вирусной полимеразы в трансфецированных клетках Cos-1 использовали минигеном этого штамма, который включает гены вирусных белков PB1, PB2, PA и NP. На основе сегмента 8 были созданы две репортерные конструкции в составе плазмиды pHW2000, которые содержат прямую или инвертированную последовательность NS1-GFP-NS2 для экспрессии белков NS2 и NS1, трансляционно слитных с зелёным флуоресцентным белком (GFP). При совместной трансфекции с минигеномом репортерные конструкции позволяют оценить транскрипционную и/или репликативную функции полимеразы вируса гриппа. Так было установлено, что полимераза вируса А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) обладает более высокой репликативной и транскрипционной активностью при 33ºС, чем при 37°С. При этом транскрипционная активность полимеразы в большей степени зависит от температуры, чем репликативная. Исследование методом минигенома полимеразы вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, вариант Mount Sinai) показало, что её репликативная и транскрипционная активности не имеют существенных различий и не зависят от температуры. Ключевые слова: обратная генетика; вирус гриппа А; полимераза вируса гриппа; минигеном вируса гриппа; зелёный флуоресцентный белок; холодоадаптированный вирус гриппа.
Keywords: cold-adapted influenza virus; green fluorescent protein; influenza A virus; influenza virus minigenome; influenza virus polymerase; reverse genetics.