The U.S. Department of Agriculture Avian Disease and Oncology Laboratory currently relies on live birds of specific genetic backgrounds for producing chicken-embryo fibroblasts that are used for the diagnosis and subtyping of field isolates associated with avian leukosis virus (ALV) outbreaks. As an alternative to maintaining live animals for this purpose, we are currently developing cell lines capable of achieving the same result by ablation of the entry receptors utilized by ALV strains. We used CRISPR-Cas9 on the cell fibroblast-derived cell line DF-1 to disrupt the tva gene, which encodes the receptor required for binding and entry of ALV-A into cells. We ultimately identified seven DF-1 clones that had biallelic and homozygous indels at the Cas9 target site, exon 2 of tva. When tested in vitro for their ability to host ALV-A, the five clones that had frameshift mutations that disrupted the Tva protein were unable to support ALV-A replication. This result clearly demonstrates that modified cell lines can be used as part of a battery of tests to determine ALV subtype for isolate characterization, thus eliminating the need for live birds.
Nota de investigación- La ablación dirigida del exón 2 del gene del receptor del virus de la leucosis aviar A (ALV-A) en una línea celular de fibroblastos de pollo mediante CRISPR anula la infección por ALV-A. El Laboratorio de Oncología y Enfermedades Aviares del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. actualmente depende de aves vivas con antecedentes genéticos específicos para producir fibroblastos de embrión de pollo que se utilizan para el diagnóstico y la subtipificación de aislamientos de campo asociados con brotes del virus de la leucosis aviar (ALV). Como alternativa al mantenimiento de animales vivos para este propósito, actualmente se están desarrollando líneas celulares capaces de lograr el mismo resultado mediante la ablación de los receptores de entrada utilizados por las cepas ALV. Se utilizó el método repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas o CRISPR-Cas9 en la línea celular DF-1 derivada de fibroblastos para interrumpir el gene Tva, que codifica el receptor requerido para la unión y entrada de ALV-A en las células. Finalmente, se identificaron siete clones de DF-1 que tenían inserciones y deleciones (indeles) bialélicos y homocigóticos en el sitio blanco Cas9, exón 2 del gene tva. Cuando se probó in vitro su capacidad para albergar ALV-A, los cinco clones que tenían mutaciones que involucraban al marco de lectura y que interrumpieron la proteína Tva no pudieron admitir la replicación de ALVA. Este resultado demuestra claramente que las líneas celulares modificadas se pueden utilizar como parte de una batería de pruebas para determinar el subtipo de ALV para la caracterización de los aislamientos, eliminando así la necesidad de aves vivas.
Keywords: avian leukosis and sarcoma virus; avian leukosis virus.