Inorganic pyrophosphatase (iPPase) is an enzyme that cleaves pyrophosphate into two phosphate molecules. This enzyme is an essential component of in vitro transcription (IVT) reactions for RNA preparation as it prevents pyrophosphate from precipitating with magnesium, ultimately increasing the rate of the IVT reaction. Large-scale RNA production is often required for biochemical and biophysical characterization studies of RNA, therefore requiring large amounts of IVT reagents. Commercially purchased iPPase is often the most expensive component of any IVT reaction. In this paper, we demonstrate that iPPase can be produced in large quantities and high quality using a reasonably generic laboratory facility and that laboratory-purified iPPase is as effective as commercially available iPPase. Furthermore, using size exclusion chromatography coupled with multi-angle light scattering and dynamic light scattering, analytical ultracentrifugation, and small-angle X-ray scattering, we demonstrate that yeast iPPase can form tetramers and hexamers in solution as well as the enzymatically active dimer. Our work provides a robust protocol for laboratories involved with RNA in vitro transcription to efficiently produce active iPPase, significantly reducing the financial strain of large-scale RNA production.
La pyrophosphatase inorganique (iPPase) est une enzyme qui clive le pyrophosphate en deux molécules de phosphate. Cette enzyme est un composant essentiel des réactions de transcription in vitro (TIV) pour la préparation d’ARN, car elle empêche le pyrophosphate de précipiter avec le magnésium, ce qui augmente finalement la vitesse de la réaction de TIV. La production d’ARN à grande échelle est souvent requise pour les études de caractérisation biochimique et biophysique de l’ARN, ce qui nécessite de grandes quantités de réactifs pour la TIV. L’iPPase achetée dans le commerce est souvent le composant le plus cher de toute réaction de TIV. Dans cet article, les auteurs démontrent que l’iPPase peut être produite en grandes quantités avec une haute qualité en utilisant une installation de laboratoire raisonnablement générique, et que l’iPPase purifiée en laboratoire est aussi efficace que l’iPPase disponible dans le commerce. De plus, en utilisant la chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion multiangle de la lumière et à la diffusion dynamique de la lumière, l’ultracentrifugation analytique et la diffusion de rayons X aux petits angles, ils démontrent que l’iPPase de levure peut former des tétramères et des hexamères en solution, ainsi que le dimère enzymatiquement actif. Ce travail offre un protocole robuste pour les laboratoires engagés dans la transcription in vitro d’ARN afin de produire efficacement l’iPPase active, réduisant ainsi de manière significative les contraintes financières de la production d’ARN à grande échelle. [Traduit par la Rédaction]
Keywords: RNA in vitro transcription; analytical ultracentrifuge; diffusion des rayons X aux petits angles; iPPase; inorganic pyrophosphatase; pyrophosphatase inorganique; small-angle X-ray scattering; transcription in vitro de l’ARN; ultracentrifugeuse analytique.