Objective: Leishmania RNA virus was detected the first time in the New World Leishmania species. Recent studies were also showed the presence of Leishmania RNA virus 2 (LRV2) in Old Word Leishmania species including Turkish L. major and L. tropica isolates. This study aimed to increase the sensitivity of qPCR with a modification in the denaturation step of cDNA preparation protocol.
Methods: In this study, LRV2+ three L. major, two L. tropica strains and L. major control strain (MHOM/SU/73/5-ASKH) were included. Total RNA isolation was done using different numbers of Leishmania promastigotes (108, 105 and 103). Before cDNA synthesis, samples were denatured at 95 °C for 2 min, as a modification of the kit procedure. qPCR was undertaken using 0.5 mM primers (LRV F-HR/LRV R-HR) diluted in SYBR Green Master mix.
Results: We observed lower Ct values in amplicons with the modified version than with the classical kit protocol for cDNA synthesis, in all of the strains used in the study. The addition of pre-denaturation step at 95 °C showed lower Ct values meaning the sensitivity increased. Different parasite dilutions showed similar results.
Conclusion: It is important to increase the sensitivity especially with the aim for detecting LRV in clinical samples obtained from patients probably have less number of parasites. The presence and burden of the virus can help to understand the relationship between the clinical findings and the pathogenicity of the parasite which may lead to changes in the course of treatment.
Amaç: Leishmania RNA virüsü, ilk olarak yeni dünya Leishmania türlerinde tespit edilmiştir. Son çalışmalar, Türkiye’deki L. major, L. tropica izolatları dahil olmak üzere, eski dünya Leishmania türlerinde de Leishmania RNA virüsü 2’nin (LRV2) varlığını göstermiştir. Bu çalışmada LRV2’nin tespiti için cDNA hazırlama protokolünün denatürasyon aşamasında yapılan bir modifikasyon ile qPCR’nin duyarlılığının artırılması amaçlanmıştır.
Yöntemler: Bu çalışmada, LRV2+ 3 L. major, 2 L. tropica ve kontrol olarak L. major (MHOM/SU/73/5- ASKH) suşları kullanılmıştır. Total RNA izolasyonu 108, 105 ve 103 sayılarına ulaşan Leishmania promastigotları kullanılmıştır. cDNA sentezinden önce numuneler, kit prosedüründen farklı olarak 95 °C’de 2 dakika denatüre edilmiştir. qPCR, SYBR Green Master karışımında seyreltilmiş 0,5 mM primerler (LRV F-HR/LRV R-HR) kullanılarak yapılmıştır.
Bulgular: Klasik kit prosedüründen farklı olarak 95 °C’de ön denatürasyon adımının eklenmesi, duyarlılığın arttığını gösteren daha düşük Ct değerleri ortaya çıkarmıştır. Farklı parazit dilüsyonları ile de benzer sonuçlar gözlenmiştir.
Sonuç: Özellikle hastalardan elde edilen klinik örneklerde muhtemelen daha az sayıda parazit bulunması nedeniyle, LRV’nin saptanabilmesi amacıyla duyarlılığın artırılması önemlidir. Virüsün varlığı ve yükü, klinik bulgular ile parazitin patojenliği arasındaki ilişkiyi anlamaya yardımcı olabilecek ve bu da tedavi aşamasında değişikliklere yol açabilecektir.
Keywords: Leishmania; Leishmania RNA virus 2; LRV2; cDNA; qPCR.
©Copyright 2022 Turkish Society for Parasitology