Background: Occludin protein is the primary assembling protein of TJs and the structural basis for tight junction formation between Sertoli cells in the spermatogenic epithelium. The expression of miR-122-5p and occludin are negatively correlated. In order to investigate the regulation mechanism of miR-122-5p on occludin and TJ, the present study isolated primary Sertoli cells from C57BL/6 mice, identified a transcription factor of miR-122-5p in testicle, studied the modulating loci of miR-122-5p on occludin using a dual-luciferase reporter assay, analyzed the regulate of miR-122-5p on the expression of occludin with real-time RT-PCR and Western blot, and studied the effect of miR-122-5p on the tight junction using a Millicell Electrical Resistance System.
Results: The relative luciferase activity in the pcDNA-Sp1 + pGL3-miR-122-5p promoter group was significantly higher than that in the pcDNA-Sp1 + pGL3-basic group, which suggests that transcript factor Sp1 promotes the transcription of miR-122-5p. The relative luciferase activity in the occludin 3'-UTR (wt) + miR-122-5p mimic group was significantly lower than that in the other groups (p < 0.01), which indicates that miR-122-5p modulates the expression of occludin via the ACACTCCA sequence of the occludin-3'UTR. The levels of occludin mRNA and protein in the miR-122-5p mimic group were significantly lower than that in the other groups (p < 0.05), which indicates that miR-122-5p reduces the expression of occludin. The trans-epithelial resistance of the miR-122-5p mimic group was significantly lower than that of the blank control group after day 4 (p < 0.05), which indicates that miR-122-5p inhibited the assembly of the inter-Sertoli TJ permeability barrier in vitro.
Conclusion: These results displayed that miR-122-5p could regulate tight junctions via the Sp1-miR-122-5p-occludin-TJ axis.
Abstrait: CONTEXTE: La protéine occludine est. la principale protéine d’assemblage des jonctions serrées (JS), et la base structurelle pour la formation de ces jonctions entre les cellules de Sertoli dans l’épithélium séminifère. L’expression de miR-122-5p et de l’occludine sont négativement corrélées. Afin d’étudier le mécanisme de régulation de l’occludine et des TJ par miR-122-5p, nous avons, dans la présente étude, isolé des cellules primaires de Sertoli de souris C57BL/6, identifié un facteur de transcription de miR-122-5p dans le testicule, étudié les loci de miR-122-5p modulants l’occludine par le biais d’un système rapporteur à 2 luciférases, analysé la régulation de miR-122-5p sur l’expression de l’occludine par qRT-PCR et Western blot, et étudié l’effet de miR-122-5p sur les jonctions serrées à l’aide d’un Système de Résistance Electrique Millicell. RéSULTATS: L’activité relative de la luciférase dans le groupe du promoteur de pcDNA46 Sp1 + pGL3-miR-122-5p était significativement plus élevée que celle observée dans le groupe pcDNA-Sp1 + pGL3-basique, ce qui suggère que le facteur de transcription Sp1 favorise la transcription de miR-122-5p. L’activité relative de la luciférase dans le groupe 3′-UTR (wt) + miR-122-5p mimant l’occludine était significativement inférieure à celle des autres groupes (p < 0,01), ce qui indique que miR-122-5p module l’expression de l’occludine via la séquence ACACTCCA en 3′ UTR de l’occludine. Les niveaux d’ARNm et de protéine occludine dans le groupe mimant miR-122-5p étaient significativement inférieurs à ceux des autres groupes (p < 0,05), ce qui indique que miR-122-5p inhibe l’expression de l’occludine. La résistance transépithéliale du groupe mimant miR-122-5p était significativement inférieure à celle du groupe témoin vierge après le jour 4 (p < 0.05), ce qui indique que miR-122-5p inhibe in vitro l’assemblage des jonctions serrées de la barrière de perméabilité inter-Sertolienne.
Conclusions: Ces résultats montrent que miR-122-5p pourrait réguler les jonctions serrées via l’axe Sp1-miR-122-5p-occludine.
Keywords: Mice; Occludin; Sertoli cell; Sp1; Tight junction; miR-122-5p.