A bioinformatics approach using single-nucleotide polymorphism (SNP) analysis was performed to improve the current real-time reverse transcription-PCR (RRT-PCR) tests for the rapid detection of Newcastle disease virus (NDV). In total, 422 NDV complete genomes were analyzed using the Virus Pathogen Resource to compare the conservation of the primer and probe sequences and to select regions to develop new RRT-PCR tests. The sensitivity and specificity of the three new RRT-PCR tests targeting the nucleoprotein (NP) and polymerase (L) genes were optimized and were compared with established tests for NDV detection. The SNP analysis was also used to identify the number of mismatches between selected primers/probes and the NDV complete genome sequences. The SNP analysis, averaged over the entire primer or probe, showed the primer/probe sequences of three new tests were more conserved than the primer/probe sequences of the commonly used test targeting the matrix (M) gene. The M RRT-PCR test was compared with the new tests on a panel of 46 viruses, comprising 31 NDV isolates. Limit of detection (LOD) varied from 1.3 to 3.7 log 50% egg-infective doses using five isolates from different genotypes by all tests. The two RRT-PCR tests targeting the L and M genes detected three out of five isolates with the lowest LOD. The NP and M RRT-PCR tests had the lowest and highest rates of genetic variants, respectively, among all probes. Because currently used tests are likely to miss some isolates, the availability of validated alternative tests provides alternatives for detection of viral variants that can be rapidly deployed to diagnostic laboratories.
Análisis del polimorfismo de un nucleótido simple para seleccionar regiones conservadas para establecer prueba mejoradas de transcripción reversa y PCR en tiempo real específicas para el virus de la enfermedad de Newcastle. Se llevó a cabo un enfoque bioinformático utilizando el análisis del polimorfismo de un nucleótido simple (SNP) para mejorar las pruebas actuales de transcripción reversa y PCR en tiempo real (RRT-PCR) para la detección rápida del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). Se analizaron un total de 422 genomas completos del virus de Newcastle utilizando la base de datos llamada Recursos en Patógenos Virales (Virus Pathogen Resource) para comparar la conservación de las secuencias de iniciadores y de sondas y para seleccionar regiones adecuadas para desarrollar nuevas pruebas de transcripción reversa y PCR en tiempo real. La sensibilidad y especificidad de las tres nuevas pruebas dirigidas a los genes de la nucleoproteína (NP) y de la polimerasa (L) se optimizaron y se compararon con las pruebas establecidas para la detección del virus de Newcastle. El análisis del polimorfismo de un nucleótido simple también se usó para identificar el número de discrepancias entre los iniciadores y sondas seleccionados con las secuencias completas del genoma del virus de Newcastle. El análisis del polimorfismo de un nucleótido simple, promediado sobre el iniciador o sonda completos, mostró que las secuencias de iniciadores y sondas de las tres pruebas nuevas estaban más conservadas que las secuencias de iniciadores y sondas de la prueba comúnmente utilizada dirigida al gene de la matriz (M). La prueba dirigida para la matriz se comparó con las pruebas nuevas mediante un panel de 46 virus, que comprendió 31 virus de Newcastle. El límite de detección (LOD) mostró un rango de 1.3 a 3.7 logaritmos de dosis infecciosas de embrión de pollo 50% usando cinco aislamientos de diferentes genotipos en todas las pruebas. Las dos pruebas dirigidas a los genes L y M detectaron tres de cinco aislamientos con los límites de detección más bajos. Las pruebas dirigidas a los genes NP y M mostraron las tasas más bajas y las más altas de variantes genéticas, respectivamente, de entre todas las sondas. Debido a que es probable que las pruebas utilizadas actualmente pueden omitir algunos aislamientos, la disponibilidad de pruebas alternativas validadas proporciona alternativas para la detección de variantes virales que se pueden establecer rápidamente en los laboratorios de diagnóstico.
Keywords: NDV; RRT-PCR; SNP; diagnostic; virus.