In order to understand the key parameters influencing drug susceptibility, different Trypanosoma cruzi assay protocols were evaluated using a comparative assay design. The assays compared in this study were an image-based intracellular T. cruzi assay quantified through an image-mining algorithm and an intracellular assay utilizing a β-galactosidase-expressing T. cruzi strain. Thirty-one reference compounds known to exhibit activities against intracellular T. cruzi were used as benchmarks. Initial comparison using EC50 values from two assays showed a very poor correlation, with an R2 value of 0.005. Nitroheterocyclics and CYP51 inhibitors were inactive in an image-based assay, but were highly active in a colorimetric assay. In order to identify the differentiating factor, we synchronized the compound-parasite incubation times or the sequential cell and compound seeding schemes between assays, but the correlation remained low. A high correlation ( R2 = 0.86) was observed only after both compound incubation time and cell seeding were synchronized between assays. Further analysis of EC50 and maximum inhibition values showed that nitroheterocyclics and CYP51 inhibitors exhibit relatively large deviations in activity between experimental protocols routinely used for in vitro intracellular T. cruzi assays. These findings suggest that the factors mentioned are critical when designing an intracellular T. cruzi assay.
薬剤感受性に影響を及ぼす重要なパラメータを把握することを目的に、比較測定デザインを用いて、異なるクルーズトリパノソーマ（T. cruzi）測定プロトコールを評価した。本試験で比較した測定法は、イメージマイニングアルゴリズムにより定量を行う画像によるT. cruzi測定法と、βガラクトシダーゼを発現するT. cruzi株を用いた細胞内測定法であった。細胞内T. cruziに対し活性を示すことが知られている31種類の標準化合物をベンチマークとして用いた。2種類の測定法で得られたEC50値を用いた最初の比較では、相関がきわめて低いことが示され、R2値は0.005であった。ニトロ複素環化合物およびCYP51阻害薬は、画像による測定法では不活性であったが、比色定量法では活性が高かった。識別因子を特定するため、化合物-寄生生物インキュベーション時間または細胞および化合物の逐次的播種法を測定法間で合わせたが、相関は低いままであった。化合物インキュベーション時間と細胞播種法の両方を測定法間で合わせた場合にのみ、高い相関（R2＝0.86）が認められた。EC50値と最大阻害値をさらに解析した結果、ニトロ複素環化合物とCYP51阻害薬は、試験管内での細胞内T. cruzi測定において日常的に用いられている実験プロトコール間で活性に比較的大きい偏差を示すことが認められた。以上の結果から、細胞内T. cruzi測定のデザインを決定する際には、上記の因子が重要であることが示唆される。
약물 감수성에 영향을 미치는 주요 매개변수를 이해하기 위해, 비교 분석법 설계를 통해 다양한 크루스파동편모충 분석법 프로토콜을 평가했습니다. 이 연구에서 비교된 분석법은 이미지 마이닝 알고리즘을 통해 정량화된 이미지 기반 세포내 크루스파동편모충 분석법과 β-갈락토시다아제 발현 크루스파동편모충 균주를 이용한 세포내 분석법이었습니다. 세포내 크루스파동편모충에 대해 활성을 나타내는 것으로 알려진 서른 한 개의 표준물질이 기준 화합물로 사용되었습니다. 두 가지 분석법을 통해 얻은 EC50 값을 사용한 초기 비교에서는 R2 값이 0.005로 상관관계가 매우 낮은 것으로 나타났습니다. 질소헤테로고리(Nitroheterocyclics) 및 CYP51 억제제는 이미지 기반 분석법에서 불활성을 보였으나, 비색(Colorimetric) 분석법에서는 활성도가 높게 나타났습니다. 차별화된 요소를 확인하기 위해, 화합물 기생충 배양 시간을 일치시키거나 분석법 간 세포 및 화합물의 순차적 파종 방식을 일치시켰으나, 상관관계는 여전히 낮았습니다. 분석법 간 화합물 배양 시간과 세포 파종을 모두 일치시킨 후에만 높은 상관관계(R2 = 0.86)가 관찰되었습니다. EC50 및 최대 억제 값을 추가로 분석한 결과, 질소헤테로 고리 및 CYP51 억제제 활성은 시험관내 세포내 크루스파동편모충 분석법에 일반적으로 사용된 실험 프로토콜 간에 상대적으로 큰 편차를 보이는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 언급된 요소가 세포내 크루스파동편모충 분석법 설계 시 중요하다는 것을 시사합니다.
为了确定影响药敏结果的关键参数，使用比较性分析设计对不同的克氏锥虫检测方案进行评估。本研究中比较的检测方案是一种基于图像的细胞内克氏锥虫检测方法（其通过图像挖掘算法进行定量分析）和一种利用表达 β-半乳糖苷酶的克氏锥虫株进行细胞内分析的检测方法。使用 31 种已知对细胞内克氏锥虫表现出活性的化合物作为基准。使用来自两种检测方法的 EC50 值进行初始比较，结果表明相关性很差，R2 值为 0.005。氮杂环类和 CYP51 抑制剂在基于图像的检测中均无活性，但在比色法检测中表现出高度活性。为了确定差异因素，我们对不同检测方案之间的化合物-寄生虫孵育时间或连续细胞和化合物接种时间表进行校正，但相关性仍然很低。仅在将检测方案之间的混合物孵育时间和细胞接种进行校正后，才观察到高相关性 (R2 = 0.86)。进一步分析 EC50 和最大抑制值发现，体外细胞内克氏锥虫检测中常规使用的实验方案中氮杂环和 CYP51 抑制剂的活性存在巨大偏差。这些研究结果表明，所述因素对于细胞内克氏锥虫检测方案设计非常重要。
為了確定影響藥敏結果的關鍵參數，使用比較性分析設計對不同的克氏錐蟲檢測方案進行評估。本研究中比較的檢測方案是一種基於圖像的細胞內克氏錐蟲檢測方法（其透過圖像挖掘演算法進行定量分析）和一種利用表達 β-半乳糖苷酶的克氏錐蟲株進行細胞內分析的檢測方法。使用 31 種已知對細胞內克氏錐蟲表現出活性的化合物作為基準。使用來自兩種檢測方法的 EC50 值進行初始比較，結果表明相關性很差，R2 值為 0.005。氮雜環類和 CYP51 抑制劑在基於圖像的檢測中均無活性，但在比色法檢測中表現出高度活性。為了確定差異因素，我們對不同檢測方案之間的化合物-寄生蟲孵育時間或連續細胞和化合物接種時間表進行校正，但相關性仍然很低。僅在將檢測方案之間的混合物孵育時間和細胞接種進行校正後，才觀察到高相關性 (R2 = 0.86) 。進一步分析 EC50 和最大抑制值發現，體外細胞內克氏錐蟲檢測中常規使用的實驗方案中氮雜環和 CYP51 抑制劑的活性存在巨大偏差。這些研究結果表明，所述因素對於細胞內克氏錐蟲檢測方案設計非常重要。
Keywords: Trypanosoma cruzi; cell-based assay; high-content assay; susceptibility.