Introduction: The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was employed for rapid detection of ethambutol (EMB) resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.
Materials and methods: From 182 clinical isolates of M tuberculosis collected from different regions, 103 strains were entered in the investigation. DNA was extracted by Chelex 100 method and PCR was performed using specific primers for embB gene. Polymerase chain reaction products were digested with HaeIII and NlaII restriction endonucleases and the patterns of restriction fragments were analysed. Some randomly selected samples were sequenced.
Results: Out of 103 studied strains, 52 were resistant to EMB. The cases of secondary tuberculosis were 53 (51.50 ± 1.77%), and primary cases 50 (48.50 ± 1.77%; p > 0.05). From 63 extensively drug-resistant (XDR), pre-XDR and multidrug-resistant (MDR) isolates, 27 (87%), 18 (81.8%) and 7 (70%) strains were resistant to EMB, respectively. Results of PCR-RFLP method showed that from 27R EMB XDR isolates, 13 (sensitivity 48% with CI: 0.307, 0.66 and specificity 100%), from 18R EMB pre-XDR strains, 4 (sensitivity 22% with CI: 0.09, 0.45 and specificity 100%) and of 7R EMB MDR, 2 (sensitivity 28% with CI: 0.082, 0.64 and specificity 100%) had mutation in ATG-Met codon 306. Results of sequencing were concordant with RFLP method. Overall, sensitivity of the molecular method was 36.5% (CI: 0.09, 0.45) and specificity 100%. None of the 40 pansusceptible strains was embB306 mutants. Extensively drug-resistant strains had a higher proportion of embB306 mutants (43%) than pre-XDR and MDR isolates (odds ratio 6.78; p < 0.001).
Conclusion: Fast detection of susceptibility to EMB drug is possible by PCR-RFLP. The embB306 locus is a candidate marker for rapid prediction of high resistance consisting of MDR and XDR forms to anti-tuberculosis drugs using this method.
Introducción:: El método de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción amplificados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) fue empleado para la detección rápida de aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis resistentes al etambutol (EMB).
Materiales y métodos:: De 182 aislados clínicos de M. tuberculosis recogidos de diferentes regiones, 103 cepas fueron tomadas para la investigación. Se extrajo el ADN por el método de Chelex100 y se realizó el PCR usando iniciadores específicos para el gene embB. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa fueron digeridos con endonucleasas de restricción HaeIII y NlaII, y se analizaron los patrones de fragmentos de restricción. Algunas muestras seleccionadas al azar fueron secuenciadas.
Resultados:: De 103 cepas estudiadas, 52 fueron resistentes al EMB. Los casos de tuberculosis secundaria fueron 53 (51.50 ± 1.77%), y los casos de tuberculosis primaria 50 (48.50 ± 1.77%; p > 0.05). De 63 aislados (XDR), pre-XDR y multirresistentes (MDR) extremadamente resistentes a los medicamentos, 27 (87%), 18 (81.8%) y 7 (70%) cepas fueron resistentes al EMB, respectivamente. Los resultados del método PCR-RFLP mostraron que de 27 aislados XDRR EMB 13 (sensibilidad 48% con IC: 0.307, 0.66 y especificidad 100%); 18 cepas pre-XDRR EMB, 4 (sensibilidad 22% con IC: 0.09, 0.45 y especificidad 100%) y de 7 MDRR EMB, 2 (sensibilidad 28% con IC: 0,082, 0.64 y especificidad 100%) presentaron mutación en el codón 306ATG-Met. Los resultados de la secuenciación estuvieron en concordancia con el método RFLP. En general, la sensibilidad del método molecular fue 36.5% (IC: 0.09, 0.45), y la especificidad 100%. Ninguna de las 40 cepas pansusceptibles fue mutante embB306. Las cepas extremadamente fármacorresistentes tuvieron una mayor proporción de mutantes embB306 (43%) que los aislados pre-XDR y MDR(odds-ratio 6.78; p < 0.001).
Conclusión:: Mediante el PCR-RFLP, es posible la detección rápida de susceptibilidad al fármaco EMB. El locus de embB306 es un marcador candidato para la predicción rápida de alta resistencia de formas MDR y XDR a medicamentos contra la tuberculosis utilizando este método.