Background: Bordetella pertussis infections continue to be a major public health challenge in Canada. Polymerase chain reaction (PCR) assays to detect B pertussis are typically based on the multicopy insertion sequence IS481, which offers high sensitivity but lacks species specificity.
Methods: A novel B pertussis real-time PCR assay based on the porin gene was tested in parallel with several previously published assays that target genes such as IS481, ptx-promoter, pertactin and a putative thialase. The assays were evaluated using a reference panel of common respiratory bacteria including different Bordetella species and 107 clinical nasopharyngeal specimens. Discrepant results were confirmed by sequencing the PCR products.
Results: Analytical sensitivity was highest for the assay targeting the IS481 element; however, the assay lacked specificity for B pertussis in the reference panel and in the clinical samples. False-positive results were also observed with assays targeting the ptx-promoter and pertactin genes. A PCR assay based on the thialase gene was highly specific but failed to detect all reference strains of B pertussis. However, a novel assay targeting the porin gene demonstrated high specificity for B pertussis both in the reference panel and in clinical samples and, based on sequence-confirmed results, correctly predicted all B pertussis-positive cases in clinical samples. According to Probit regression analysis, the 95% detection limit of the new assay was 4 colony forming units/reaction.
Conclusion: A novel porin assay for B pertussis demonstrated superior performance and may be useful for improved molecular detection of B pertussis in clinical specimens.
Historique: Les infections à Bordetella pertussis continuent d’être un important problème de santé publique au Canada. Les méthodes de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour déceler le B pertussis sont habituellement fondées sur la séquence d’insertion multicopie IS481, dont la sensibilité élevée, mais dont la spécificité d’espèce est inexistante.
Méthodologie: Une nouvelle méthode PCR en temps réel du B pertussis fondée sur le gène de porine a été mise à l’essai parallèlement à plusieurs méthodes déjà publiées qui ciblent des gènes comme l’IS481, le promoteur de ptx, la pertactine et une thialase éventuelle. Les méthodes ont été évaluées à l’aide d’un groupe de référence de bactéries respiratoires communes, y compris diverses espèces de Bordetella et 107 échantillons nasopharyngés cliniques. Les résultats contradictoires ont été confirmés par séquençage des produits de PCR.
Résultats: La méthode visant l’élément IS481 avait la sensibilité analytique la plus élevée, mais manquait de spécificité pour le B pertussis dans le groupe de référence et les échantillons cliniques. Les méthodes ciblant les gènes du promoteur de ptx et de la perctatine ont également donné des résultats faux positifs. Une méthode de PCR fondée sur le gène thialase était hautement spécifique, mais ne décelait pas toutes les souches de référence du B pertussis. Cependant, une nouvelle méthode ciblant le gène de porine a démontré une forte spécificité au B pertussis, à la fois dans le groupe de référence et dans les échantillons cliniques et, d’après les résultats confirmés par séquençage, prédit correctement tous les cas positifs au B pertussis dans les échantillons cliniques. D’après l’analyse de régression Probit, la limite de détection de 95 % de la nouvelle méthode était de quatre unités formant colonies par réaction.
Conclusion: Une nouvelle méthode faisant appel à la porine pour déceler le B pertussis donne un rendement supérieur et peut être utile pour améliorer la détection moléculaire du B pertussis dans des échantillons cliniques.
Keywords: Bordetella pertussis; IS481 element; Pertactin gene; Porin gene; Ptx-promoter; Real-time PCR.